Genomic editing of the B cells in order to obtain therapeutic antibody secretion
Edition génomique de la lignée B en vue de la sécrétion d'anticorps thérapeutiques
Résumé
Immunotherapy has had resounding success, first with the generalization of monoclonal antibodies (mAb) in the clinic, then more recently with the development of adoptive immunotherapy strategies based on T cells genetically modified to acquire a new antigenic specificity via the expression of a "chimeric antigen receptor" (CAR). Until now, this genetic engineering was done randomly using viral vectors. Due to their simplicity and targeting efficiency, CRISPR/Cas9 methods have completely changed the game of genome editing. These fast-growing approaches are increasingly well mastered and are diversifying in terms of methods, expressed receptors, and “edited” cell lines, making it possible to envisage the production of recombinant therapeutic molecules by reformatted B cells. Their capacity to differentiate into long-lived plasma cells or memory B cells could ensure both the permanent production of a large quantity of antibodies and the immune surveillance of the host via memory B cells edited for their BCR. Another advantage of BCR-edited B cells is their ability to rearrange their immunoglobulin (Ig) genes to induce isotype class switching. In this work, we sought to exploit these multiple properties, on the one hand by validating the expression and functionality of a new single-chain mAb format, capable of being expressed via the insertion of a single gene cassette, and on the other hand by diversifying our editing strategies using the CRISPR/Cas9 tool. For these different strategies, we chose to target two loci that are highly expressed in human B cells (IgH and JCHAIN) in order to obtain the secretion of therapeutic molecules. Using this type of approach, we have succeeded, by integrating our template, in inducing the expression of Ig with anti-HER2 or anti-CD20 specificity, in particular in the IgA2-switched format. In the context of COVID crisis, we have also developed a strategy of induced switch to the IgA2 class for a spike-specific hybridoma (in order to obtain the expression of this Ig class important for mucosal immunity). The in vivo validation of an immunotherapy based on B-cell engineering requires the development of a suitable mouse model in order to benefit from pre-clinical testing. An important aspect of this thesis work was therefore also the establishment of the best conditions for the engraftment of human B cells in an immunodeficient mouse and the development of in vivo human CD20+ or HER2+ tumor models.
L’immunothérapie a connu des succès retentissants, d’abord avec la démocratisation en clinique des anticorps monoclonaux (mAb), puis plus récemment avec la mise au point de stratégies d’immunothérapie adoptive basées sur des cellules T modifiées génétiquement pour acquérir une nouvelle spécificité antigénique via l’expression d’un « chimeric antigen receptor » (CAR). Jusqu’à présent cette ingénierie génétique se faisait de manière aléatoire à l’aide de vecteurs viraux. De par leur simplicité et leur efficacité de ciblage, les méthodes CRISPR/Cas 9 ont complètement rebattu les cartes du jeu de l’édition du génome. Ces approches en plein essor sont de mieux en mieux maîtrisées et se diversifient ainsi quant aux méthodes, aux récepteurs exprimés, et aux lignées « éditées », permettant aujourd’hui d’envisager l’intérêt d’une production de molécules thérapeutiques recombinantes par des cellules B reformatées. Leur capacité de différenciation en plasmocytes à longue durée de vie ou en cellules B mémoires pourrait en effet assurer tant la production permanente d’une grande quantité d’anticorps, que la surveillance immunitaire de l’hôte via des cellules B mémoires éditées pour leur BCR. Un autre atout de cellules B porteuses d’un BCR édité tiendrait à leur capacité de remaniérer leurs gènes d’immunoglobulines (Ig) pour notamment induire la commutation de classe isotypique.Dans ce travail, nous avons cherché à exploiter ces nombreuses propriétés, d’une part en validant l’expression et la fonctionnalité d’un nouveau format de mAb simple chaine, propre à s’exprimer via l’insertion d’une cassette génétique unique, et d’autre part en diversifiant nos stratégies d’édition à l’aide de l’outil CRISPR/Cas9. Nous avons choisi pour ces différentes stratégies de cibler deux locus s’exprimant fortement dans les cellules B humaines (IgH et JCHAIN) afin d’obtenir la sécrétion de molécules thérapeutiques. Par ce type d’approche nous avons, par intégration de notre cassette réussi à induire l’expression d’Ig de spécificité anti-HER2 ou anti-CD20, en particulier sous forme switchée à IgA2. Dans le contexte de la crise COVID, nous avons également développé une stratégie de switch induit vers la classe les IgA2 pour un hybridome spike-spécifique (afin d’obtenir l’expression de cette classe d’Ig importante pour l’immunité muqueuse).La validation in vivo d’une immunothérapie basée sur l’ingénierie des cellules B nécessite, pour pouvoir bénéficier de tests pré-cliniques, la mise au point d’un modèle murin adapté. Un aspect important de ce travail de thèse a donc aussi consisté en l’établissement des meilleures conditions d’implantation de cellules B humaines chez une souris immunodéficiente et en l’élaboration in vivo de modèles tumoraux CD20 humain+ ou HER2+.
Domaines
Médecine humaine et pathologie
Origine : Version validée par le jury (STAR)