Photonic and nanomechanical study for label-free monitoring of the fibrotic scar in spinal cord injury in mice
Etude photonique et nano-mécanique pour le suivi sans marquage de la cicatrice fibrotique dans les lésions de la moelle épinière chez la souris
Résumé
Spinal cord injuries (SCI) are part of the most impactful pathologies in the central nervous system (CNS). They can induce dramatic physical and psycho-social effects for the patients, associated with a consequent impact on the health care system. When an injury occurs, it induces a cascade of events disturbing the surrounding structures and cell populations, and includes the formation of a glial scar. This scar is composed of various cell populations such as activated microglial and astrocytes. Fibroblasts are producing collagen with the support of reactive astrocytes and are involved in the fibrotic process. The glial scar is a dense chemical and physical barrier with dual effects on the recovery. No curative treatment is currently available. However, promising pharmaceutical approaches have been developed through the transient depletion of microglia using a GW2580 treatment, an inhibitor of CSF1R receptor that specifically regulates the proliferative part of microglial cells.The exploration of collagen in the glial scar formation has raised poor attention comparing to the interest in microglia and astrocytes roles. Fibrillar collagen as collagen I is well known in common wound healing processes occurring in the rest of the body, and is defined by a supramolecular organization in cross-striated fibril shaped into a cylindrical structure and eventually associated into fibers. This assembly leads to unique optical properties that can be directly monitored by non-linear optical measurements (NLO), such as Second Harmonic Generation (SHG), without special sample preparation and without any exogenous labeling. As SHG is a coherent signal that depends on the polarization of the incident laser by performing Polarization-resolved SHG (P-SHG) collagen fibers arrangement at a supramolecular level can be assessed related to the fibrils nature (related to their symmetry profiles).The global approach proposed in our work was to exploit the potential of NLO optics in detecting and characterizing fibrillar collagen in SCI (using Multiphoton microscopy to visualize simultaneously 2-photon excited fluorescence and SHG signals) in a mouse model and to correlate the structural information to the biomechanical behavior of the tissue via micro/nano-indentation force measurements with Atomic Force Microscopy (AFM). Collagen fibers exhibited by their SHG signal were characterized with two methods: CurveAlign software dedicated to collagen fibers analysis in biological samples and a home-build Fingerprint algorithm establishing an analysis pipeline more adapted to our study. We eventually generated a skeleton map of the fibers to extract relevant metrics such as the fibers’ density, tortuosity and orientation at local level (calculating the circular variance of the local orientation) and at global level (calculating the statistical entropy). Our multimodal label-free imaging approach was thus dedicated to reveal and monitor lesion biomarkers from the fibrotic structure and the elasticity of injured spinal cord tissues after various time-points post-injury and to investigate the potential effect of a pharmacological treatment with GW2580 at 6 weeks post injury. The SHG signal exhibited by fibrillar collagen enabled to specifically monitor it as a biomarker of the lesion. An increase in collagen fibers density and the formation of more tortuous fibers overtime from 1 week to 6 weeks post-injury was observed. P-SHG measurements revealed both fibrils symmetry types (cylindrical and trigonal) at all the time-points post injury. Nano-mechanical investigations revealed a noticeable hardening of the injured area from 1week post injury, correlated with collagen fibers’ formation.These observations indicate the concomitance of important structural and mechanical modifications during the fibrotic scar evolution following a spinal cord injury in mice.
Les lésions de la moelle épinière (LME) font partie des plus graves maladies du système nerveux central (SNC). Elles peuvent induire des effets physiques et psycho-sociaux dramatiques chez les patients et d’importants coûts pour le système de santé. Après une lésion, une cascade d’évènements est enclenchée perturbant les structures et populations cellulaires à proximité. Une des conséquences est la formation de la cicatrice gliale, constituée de diverses populations cellulaires telles que les formes activées de microglies et d’astrocytes. Les fibroblastes produisant du collagène sous l’action d’astrocytes participent au processus fibrotique. La cicatrice gliale constitue une dense barrière physique et chimique, aux effets à la fois bénéfiques et délétères. Aucun traitement curatif n’existe à l’heure actuelle. Cependant, des thérapies pharmaceutiques ont été développées, notamment par la déplétion transitoire de la microglie en utilisant le GW2580, un traitement qui inhibe le récepteur CSF1R impliqué dans la partie proliférative des cellules gliales.Le rôle du collagène dans la formation de la cicatrice gliale a été peu exploré comparé à ceux de la microglie et des astrocytes. Le collagène fibrillaire tel que le collagène de type I est bien connu dans les processus de cicatrisation classiques et se caractérise par une organisation supramoléculaire en fibrilles striées regroupées en une structure cylindre et finalement associées en fibres. Cet assemblage lui confère des propriétés optiques uniques pouvant être directement détectées par des mesures d’optique non-linéaire (ONL) telle que la génération de seconde harmonique (GSH) sans préparation ou un marquage de l’échantillon. De plus, la GSH est un signal cohérent dépendant de la polarisation du laser incident, et des mesures de GSH résolue en polarisation (P-GSH) peuvent déterminer l’arrangement supramoléculaire des fibres de collagène associé à la symétrie des fibrilles. L’approche globale proposée était d’exploiter le potentiel de l’ONL pour détecter et caractériser le collagène fibrillaire dans un modèle murin de LME, corrélant les informations structurales avec le comportement biomécanique du tissu, déterminé par microscopie à force atomique (MFA) en mesurant les forces appliquées lors de micro-nano indentations. Les fibres de collagène visibles grâce à leur signal en GSH ont été caractérisées via deux méthodes : le logiciel CurveAlign dédié à l’analyse des fibres de collagène dans les échantillons biologiques, et un algorithme codé au sein de l’équipe basé sur le «Fingerprint algorithm» pour une analyse plus adaptée à notre étude. Un « squelette » de fibres généré par cet algorithme a permis d’extraire des métriques pertinentes comme la densité de fibres, leur tortuosité, ainsi que leur orientation à un niveau local (calculant la variation circulaire de l’alignement local) et global (calculant l’entropie statistique). Le but de notre approche d’imagerie multimodale sans marquage était de révéler et suivre des biomarqueurs de la structure fibrotique, suivre l’élasticité de tissus de moelle épinière lésée à différent temps après lésion, et évaluer le potentiel effet d’un traitement au GW2580 à 6 semaines post lésion. Le signal GSH émis par le collagène fibrillaire a permis de l’identifier comme biomarqueur de la lésion. Une augmentation de la densité de fibres ainsi que la présence de fibres plus tortueuses ont été observées entre 1 et 6 semaines post lésion. Les mesures en P-GSH ont révélé la présence de deux types de symétrie des fibrilles (cylindrique et trigonal) à tous les temps après lésion. L’étude des propriétés nano-mécaniques a montré un durcissement notable de la zone lésée à partir d’une semaine post lésion, certainement corrélé à la formation de fibres de collagène.Ces observations indiquent la concomitance d’importantes modifications structurales et mécaniques au cours de l’évolution de la cicatrice fibrotique suite à une LME chez la souris.
Origine : Version validée par le jury (STAR)